附录05：国内外众多科学研究证实“基因编辑”等育种新的遗传修饰/转基因技术，可能对环境和/或健康产生造成更为隐蔽不可预料不可忽视负面影响!
支持“基因编辑”的学者研究也强调“对任何新技术的有效性和安全性进行仔细审查是合理且必要的。作为新的农作物育种技术，Cas9和Cpf1也不例外。”
科学证据(2019年3月)：《生物工程生物技术前沿》(Front Bioeng Biotechnol)发表奥地利环境局土地使用与生物安全司、德国自然保护联邦局转基因监管与生物安全司、英国牛津EcoNexus学者https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Eckerstorfer MF[Author]&cauthor=true&cauthor_uid=30891445Eckerstorfer MF et al.《欧盟对基因组编辑和其他新基因改造技术(nGM)开发的植物生物安全考虑的观点》确认：
植物育种中新的遗传修饰技术(nGM)是否可能对环境和/或健康产生不可忽视的负面影响的问题，对于有关其监管的讨论具有重要意义。
然而，解决该问题的当前知识对于大多数nGM是有限的，特别是对于最近开发的nGM，例如基因组编辑，以及它们新出现的变体，例如碱基编辑。
这导致关于植物的风险/安全状态的不确定性，所述植物是用广泛的不同nGM开发的，尤其是基因组编辑，以及其他nGM，例如顺式发生、转移、单倍体诱导或反向育种。
进行了一项文献调查，以确定由nGM开发的与未来农业用途相关的植物。分析这些nGM植物的危害(i)与其发育的性状及其使用或(ii)由nGM或育种期间应用的其他方法引起的非预期的变化。
nGM植物的未来可能具有几个特征，即除草剂抗性(HR)、对不同植物病原体的抗性以及改良的组成、形态、适应性(例如，对寒冷/霜冻、干旱或盐度的抗性增加))或改变繁殖特征。
从现有的转基因作物中已经知道一些性状，如对某些除草剂的抗性，并且它们先前的评估确定了关注和/或风险的问题，例如产生了抗除草剂杂草的问题。
nGM植物的其他特性是新颖的;这意味着它们不存在于目前栽培有安全使用历史的农业植物中，并且其潜在的生理机制尚未充分阐明。
一些基因组编辑应用的特征，例如基因组序列变化的小范围及其较高的靶向效率，即精确度，不能被认为是安全性本身的指示，特别是与由这些修饰产生的新特征有关。此处考虑的所有nGM都可能导致不同类型和频率的意外更改。
然而，nGM植物的快速发展可能损害非预期效果的检测和消除。因此，应对nGM植物进行病例特异性上市前风险评估，包括适当的分子鉴定以识别非预期的变化和/或确认不存在不需要的转基因序列。
et al.,An EU Perspective on Biosafety Considerations for Plants Developed by Genome Editing and Other New Genetic Modification Techniques (nGMs).
Front Bioeng Biotechnol., 2019 Mar 5;7:31.
et al.，欧盟对基因组编辑和其他新基因改造技术(nGM)
开发的植物生物安全考虑的观点，2019年3月
科学证据(2019年9月)：《自然--通讯》(Nature Communications)发病德克萨斯大学西南医学中心细胞生物学系、西南医学中心内科、生物化学Hamon治疗肿瘤研究中心;克利夫兰诊所勒纳研究所量化健康科学系;罗彻斯特大学医学中心生物化学与生物物理系Rubina Tuladhar et al.《基于CRISPR-Cas9的诱变经常引起靶标mRNA失调》确认：
通过非同源末端连接(NHEJ)途径引入“插入删除”(INDEL)是CRISPR-Cas9指导的基因组编辑的机制基础。
使用CRISPR-Cas9进行选择性基因切除是通过从诱导移码的突变体mRNA进行无义介导的衰变(NMD)的移码诱导INDEL安装过早终止密码子(PTC)来实现的。
在这里，通过在具有推测基因敲除的细胞系面板中检查CRISPR靶向基因的mRNA和蛋白质产物，我们检测到约50%的细胞系中外源mRNA或蛋白质的产生。
我们证明了这些异常的蛋白质产物源于“插入删除”(INDEL)的引入，这些INDEL促进内部核糖体进入，将假mRNA(使用PTC替代剪接的mRNA)转换为蛋白质编码分子或通过破坏外显子剪接增强子(ESE)诱导外显子跳跃。
我们的结果揭示了使用基于“插入删除”(INDEL)的诱变操作基因表达结果所面临的挑战，以及可用于缓解其对预期基因组编辑结果影响的策略。
Rubina Tuladhar et al., CRISPR-Cas9-based mutagenesis frequently provokes on-target mRNA misregulation, Nature Communications, 06 Sep 2019vol10, Articlenumber:4056
Tuladhar et al.，基于CRISPR-Cas9的诱变经常引起靶标mRNA失调，
自然--通讯，2019年9月，第10卷，文章号：4056
总部位于伦敦的分子遗传学家Michael Antoniou博士评论这项新研究时说：“这项研究中描述的发现，增加了基因编辑可能出错的方式。监管机构需要充分考虑基因编辑的这些和其他目标意外结果的后果，并在考虑市场批准之前，对使用这些方法生产的所有产品进行全面的健康风险评估。
GMWatch: CRISPR causes unexpected outcomes even
at the intended site of genetic modification, 2019-04-16
基因观察：基因编辑CRISPR即使在预期的遗传修饰位点
也会导致意想不到的结果，2019-04-16
https://www.gmwatch.org/en/news/latest-news/18885https://www.gmwatch.org/en/news/latest-news/18885
科学证据(2019年4月)：《基因组生物学杂志》(Genome Biology)发表瑞士苏黎世联邦理工学院生物学系分子植物生物学研究所植物生物技术实验室、加拿大艾伯塔省艾伯塔大学生物科学系植物基因组学实验室、比利时列日大学Gembloux农业生物技术公司TERRA研究与教学中心Devang Mehta et al.《对木薯进行的CRISPR-Cas9干预导致双联病毒进化出能抵抗编辑的抗性》确认：
背景：双子病毒在几种重要的农作物中引起破坏性疾病。然而，在开发对这些高度多样化的DNA病毒具有抗性的农作物品种方面进展有限。最近，细菌CRISPR / Cas9(一种“基因编辑”技术)系统已被转移到植物中，以靶向赋予双生病毒免疫力。这项研究中，我们在主粮木薯中使用CRISPR-Cas9干扰蛋白，旨在对非洲木薯花叶病毒(植物致病性DNA病毒的一个重要且广泛的家族(Geminiviridae)的成员)实施基因工程抗性。
结果：我们的结果表明，在温室接种过程中，CRISPR系统无法赋予病毒有效的抗性。此外，我们发现33%至48%的已编辑病毒基因组进化出保守的单核苷酸突变，赋予对CRISPR-Cas9切割的抗性。我们还发现在模型植物烟草本氏烟草中，新型突变病毒的复制依赖于野生型病毒的存在。
结论：我们的研究强调了真核生物与CRISPR-Cas9病毒免疫相关的风险，因为该系统的诱变特性会在短时间内产生病毒逃逸。我们对病毒种群的深入分析也为将来分析抗病毒CRISPR转基因病毒逃逸的研究提供了模板。这对于告知对CRISPR-Cas9技术在农业中的这种积极诱变应用的调控尤为重要。
Devang Mehta et al. Linking CRISPR-Cas9 interference in cassava
to the evolution of editing- resistant geminiviruses,Genome Biology, 2019 Apr 25; 20: 80.
Devang Mehta et al.，对木薯进行的CRISPR-Cas9干预导致双联病毒
进化出能抵抗编辑的抗性，基因组生物学杂志，2019年4月;20: 80.
对该项研究，第一作者Devang Mehta在采访中进一步说明：
“因为这种技术会对病毒产生生存压力，促使病毒更快速进化，同时也为病毒提供了进化的手段，导致病毒产生突变并对我们的干预产生抵抗力，”阿尔伯塔大学的博士后Devang Mehta解释说。
“研究人员使用了一种被称为CRISPR-Cas9的新型“基因编辑”技术，试图设计出能抵抗花叶病毒的破坏作用的木薯作物，这种作物可以切割花叶病毒的DNA。但他们没有成功，于是他们决定对每株植物中发现的数百种病毒基因组进行测序，以便准确了解失败的原因。
“我们发现CRISPR-Cas9给病毒带来的压力可能会促使它们进化，以增加对外来干预的抵抗能力”，Mehta说。
“CRISPR-Cas9存在于自然界中，细菌利用它来抵御病毒。然而，研究人员发现该技术在植物中产生了不同的结果 —— 研究人员强调了未来检测这些非预期结果的重要性。”
Katie Willis, Gene-editing technology to create virus-resistant
cassava plant has opposite effect, researchers find, Technology, 2019-04-26
Katie Willis, 研究者发现用基因编辑技术产生的抗病毒木薯
导致了相反的结果，技术，2019-04-26
科学证据(2019年3月)：《科学杂志》(Science)发表中国科学院神经科学研究所(中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心)、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室、中国科学院灵长类神经生物学重点实验室杨辉研究组与中国科学院上海营养与健康研究所隶属的计算生物学研究所(中国科学院-马普学会计算生物学伙伴研究所)、斯坦福大学遗传学系以及中国农业科学院深圳农业基因组研究所杨辉et al.《胞嘧啶单碱基编辑会导致大量单核苷酸突变的脱靶》。率领此项研究的中科院神经科学研究所研究员杨辉确认：
CRISPR/Cas9是广泛关注的新一代基因编辑工具，自从2012年被发明以来，一直以高效性和特异性备受世人期待，学术界普遍认为基于CRISPR/Cas9及其衍生工具的临床技术将为人类健康作出巨大贡献。然而值得注意的是，自问世以来，CRISPR/Cas9及其衍生工具的真实脱靶率一直存在争议，其脱靶风险始终没有得到充分而有效的检测。在此之前的多种检测脱靶的方案都存在一定局限性，不能高灵敏性检测到脱靶突变，尤其是单核苷酸突变。而一旦在临床中出现脱靶效应，可能会引起包括癌症在内的多种副作用。
“我们希望可以找到一种既能够不依赖于脱靶位点预测，又能有足够信噪比的精密脱靶检测手段。”杨辉说。经过一年多的努力，杨辉研究组与合作者建立了一种名叫“GOTI”的脱靶检测技术，既不依赖任何算法预测，也不依赖体外扩增，极大提高了脱靶检测的精确性和广泛性，让脱靶检测第一次进入了非常实用的阶段。
借助这一系统，团队检测了最经典的CRISPR/Cas9系统，结果发现，设计良好的CRISPR/Cas9并没有明显的脱靶效应，结束了之前对于CRISPR/Cas9脱靶率的争议。团队还检测了另一个同样被给予厚望的CRISPR/Cas9衍生技术BE3，这个系统可以精确引入点突变，在之前的研究中从未发现过有明显的脱靶问题。然而在“GOTI”的检测下发现，BE3存在非常严重的脱靶，这些脱靶大多出现在传统脱靶预测认为不太可能出现脱靶的位点。团队分析后认为，脱靶位点有部分出现在抑癌基因上，因此经典版本的BE3有着很大的隐患，目前不适合作为临床技术。
这一发现令人震惊。“要知道，在此之前，单碱基突变技术一直被认为是一种特别安全，几乎不会有脱靶的新技术，国外有多家公司都在紧锣密鼓准备将它推向临床应用。”杨辉告诉记者，“其实回过头来看，从基础的生物学理论上是可以推断出这些技术很可能有脱靶问题的，但是很多人理所当然觉得它们很安全，用传统的方法也的确没有发现脱靶问题，我们的成果在一定程度上也让业界可以冷静一点，更谨慎地对待这些新技术。”
“任何科学技术归根结底都需要服务于全人类，像基因编辑这样的技术，大家都很期待它用到临床上，治疗那些曾经无法治疗的疾病。但是我们也不能忘记，任何一种用到临床的疗法都必须要对它的风险非常清楚。有了更精确更灵敏的检测技术，将来才可能以此开发出更安全的基因编辑工具。希望我们的工作有助于尽快制定行业标准，让这个领域有序、健康地发展。”杨辉强调。
光明日报：世界首次证实单碱基基因编辑存在脱靶效应，2019-03-01
科学证据(2018年7月)：《基因组生物学》(Genome Biology)发表成都电子科技大学生命科技学院生物技术系;江苏省作物遗传与生理重点实验室，粮食作物现代生产技术协同创新中心，扬州大学植物功能基因组学教育部重点实验室;扬州大学教育部农业与农产品安全国际联合研究实验室;马里兰大学植物科学与景观建筑系、马里兰大学生物科学与生物技术研究所Xu Tang et al.《大规模全基因组测序分析揭示水稻中Cas9和Cpf1(Cas12a)核酸酶的高度特异性基因组编辑》确认：
背景：靶向特异性一直是在功能基因组学、精确医学和植物育种中应用基因组编辑系统的障碍。在植物中，只有有限的研究使用全基因组测序(WGS)来测试Cas9的脱靶作用。许多发现的突变的原因仍然是有争议的。此外，迄今尚未在任何高等生物中报告基于WGS的Cpf1(Cas12a)脱靶分析。
结果：我们对W0和T1代中的Cas9编辑的34株植物和Cpf1编辑的15株植物以及20种水稻的对照植物进行了全基因组测序(WGS)分析。测序深度范围为45倍至105倍，读取映射率超过96%。我们的结果清楚表明，经过编辑的植物中的大多数突变由组织培养过程产生，每株植物导致大约102至148个单核苷酸变异(SNV)和大约32至83个插入/缺失(indels)。
通过WGS评估的12个Cas9单向导RNA(sgRNA)和3个Cpf1 CRISPR RNA(crRNA)中，只有1个Cas9 sgRNA在计算机程序预测的位点导致T0系中的脱靶突变。此外，由于Cas9或Cpf1与T1代中的指导RNA的持续表达，我们找不到真正的脱靶突变证据。
结论：我们对多种样品类型的全基因组测序(WGS)数据进行了全面而严格的分析，表明Cas9和Cpf1核酸酶在生成靶向DNA修饰中都非常特异性，可以通过设计高特异性的指导RNA避免脱靶。
最后，我们希望我们的数据可以为监管机构和其他实体提供有价值的参考。对任何新技术的有效性和安全性进行仔细审查是合理且必要的。作为新的农作物育种技术，Cas9和Cpf1也不例外。
尽管全基因组测序(WGS)已在植物中研究了基于Cas9的脱靶效应[21,22,23]，但我们的研究在规模，深度和全面性方面与以前的研究有很大不同。我们的研究也代表了使用WGS评估Cpf1在任何编辑过的高等真核生物中脱靶的首次报道。
在由11个Cas9-sgRNA和3个Cpf1-crRNA构建体编辑的49株水稻植物中，有47株植物中没有发现脱靶突变。这种精确的基因组修饰水平与许多常规育种技术形成了鲜明的对比。例如，我们发现，即使是最安全的育种方法，从亲本系中收获种子，也会将约30至50个自发突变引入水稻的下一代。
我们还观察到每株水稻约有200种组织培养物引起的体细胞克隆变异，尽管很少有影响编码序列。
总而言之，我们的数据支持了最近的一项呼吁，即“规范基因组编辑的产品，而不是基因组编辑本身”[53]。
Xu Tang et al., A large-scale whole-genome sequencing analysis reveals highly specific genome editing by both Cas9 and Cpf1 (Cas12a) nucleases in rice,
Genome Biology, 04 July 2018; vol19, Articlenumber:84
Xu Tang et al.，大规模全基因组测序分析揭示水稻中Cas9和Cpf1(Cas12a)核酸酶的高度特异性基因组编辑。基因组生物学，2018年7月4日;第19卷文章号：84
为便于读者们更深入理解《基因组生物学》(Genome Biology)发表的中国学者们上述文章，特此全文翻译国外学者评论中国学者这项研究的文章：
科学证据(2019年1月)：《转基因观察》(GM Watch)发表Claire Robinson《声称显示CRISPR安全性的新研究表明相反结果》全文：
确认基于流程的监管是必要的
中国研究人员的一项新研究[1]在(基因编辑支持者)游说中受到赞扬，因为它表明通过CRISPR(一种“基因编辑”技术--译注)进行植物基因编辑是精确，可预测和可控制的。
然而，实际上，事实恰恰相反 -- 该项研究实际表明，CRISPR过程作为一个整体会引起大量脱靶突变。
对于我们这些对促进转基因生物不感兴趣的人来说，一个明确的结论是，需要基于过程的CRISPR作物监管，其中要考虑到用于制造它们的基因修饰(GM)程序固有的风险和缺点。
但是，游说者利用新研究的结果认为，转基因生物法规(GMO regulations)应改为基于产品：即，应仅考虑目标产品，而忽略植物产生的过程。
支持基因编辑这些游说者的目的是取消欧盟基于流程的转基因生物法规，该法规承认转基因流程的内在不确定性，并以北美等基于产品的法规代替，后者仅评估预期的最终产品的风险。
支持基因编辑游说者的推理
基因编辑游说者写道，中国学者该研究表明组织培养和“自发”突变是大多数核苷酸(DNA的基本单位)变异的来源，而非源于基因组编辑过程本身。
基因编辑游说帖子是由一家植物生物技术公司的首席执行官兼联合创始人撰写的。基因编辑游说者指出，中国学者这项新研究的作者发现，最安全的育种方法是从非转基因亲本系中收获种子，它们仅将大约30至50个自发突变引入水稻的下一代。游说帖子声称，中国这项研究的作者还观察到每株稻米约有200种组织培养物引起的体细胞克隆变异。体细胞克隆变异是从组织培养中生长的植物细胞再生的植物后代之间的遗传变异。
基因编辑游说者补充说，与“许多常规育种技术形成鲜明对比”的过程中，中国这项研究的作者发现目标基因的编辑“异常精确”，因为他们在某些CRISPR工具基因编辑的49种水稻植物中没有发现任何脱靶突变。
基因编辑游说者大写字喊话充斥游说点，“这项研究表明，为什么称较旧的育种技术比基因组编辑更安全是错误的。”游说帖子指出，这项中国研究的作者提醒监管机构应当“监管基因组编辑产品，而不是基因组” ，还总结说：“这项工作对于监管机构和科学界将是宝贵的参考。”
基因编辑游说者这样游说对吗?一如往常，我们研究了研究本身，看看结果告诉我们什么。我们惊讶地发现中国学者这项研究正在被使用(包括该项研究作者本人)，来显示CRISPR的安全性，准确性和可预测性。
中国学者这项研究的方法
该研究的作者分析了用两种不同的CRISPR核酸酶工程改造的基因编辑植物的脱靶效应和脱靶效应。
在这些研究租着认为值得称赞的“第一”中，作者分离出了基因编辑过程的不同要素，并使用全基因组测序(WGS)来计算这些要素中在植物中诱导的每一个的脱靶效应和脱靶效应数量。
作者检查的基因编辑过程的不同元素为：
* 仅组织培养
* 仅土壤杆菌感染(用于将CRISPR基因编辑工具携带到植物细胞中)，以及
* 通过农杆菌感染引入了不同的CRISPR基因编辑工具(Cas9骨架和Cpf1骨架)，但不包括将RNA导向编辑工具引导至所需位点以诱导DNA中双链断裂的指导RNA分子。
作者寻找的影响为单核苷酸变异(SNV)、大小插入/缺失(indels)和基因组重排。
此外，作为基线，作者分析了连续三代的非转基因野生型植物的“自发”突变。
调查结果
该项研究的作者发现，从野生型非转基因水稻植物中保存的种子每株植物具有30至50个自发突变。
他们发现几乎没有CRISPR编辑工具产生的脱靶效应 -- 49株植物中只有2株具有脱靶效应。
但是 -- 这是至关重要的方面 --他们从组织培养物中发现了大量突变(每株水稻植株200个)。 用作者的话说，“我们的结果清楚地表明，经过编辑的植物中的大多数突变都是由组织培养过程产生的，该过程导致大约102至148个单核苷酸变异(SNV)和每株植物大约32至83个插入/缺失(indels) 。”
组织培养是制作基因编辑(或更旧的转基因)植物的必不可少的部分。
他们研究的结果还表明“农杆菌感染是诱变的，优选引入插入缺失”。就是说，农杆菌感染增加了由组织培养引起的突变数量。
作者得出结论，由三种CRISPR编辑工具中的两种导致的脱靶突变“与自发突变或由组织培养和农杆菌感染引起的自发突变相比，在很大程度上可忽略不计。所获得的知识很可能是重要，可供植物研究人员和监管机构参考。”
这是什么意思?
基于这些发现，CRISPR(基因编辑)工具是否不会引入许多突变并不重要。最终结果仍然是来自CRISPR(基因编辑)基因操作过程其他方面的许多突变。制作CRISPR(基因编辑)植物时，通常使用组织培养，而农杆菌感染通常用于提供编辑工具 -- 后一种元素增加了组织培养引入的突变范围。
因此，不可避免的是，CRISPR's(基因编辑)植物最终将产生大量突变。
这并不是说突变的数量是最重要的 -- 这些突变造成什么效应才是最重要的。只有通过进一步的实验才能确定这一点–通过“组学”分析确定成分变化，然后进行长期动物饲喂研究以确定生物学效果。 这些可能包括意想不到的毒性或致敏性。
Logos Environmental咨询公司的Janet Cotter博士对中国学者这项新研究若干发现进行了评论：“(中国)研究人员发现，在大多数情况下，但并非所有情况下，都没有脱靶效应。这就是为什么需要进行监管 -- 以确保基因组编辑过程不会产生任何潜在的有害影响。”
Cotter博士解释说：
1)中国学者的研究发现CRISPR工具的良好设计可以最小化但不能消除脱靶效应。中国作者指出：“我们只在两个表达带有Cas9-J-sgRNA01的Cas9蛋白的T0系中发现了真正的脱靶突变。”
2)脱靶效应并不是CRISPR(基因编辑)可能引起的唯一遗传错误。可能还会出现意想不到的“靶向”效应 -- 例如，宿主DNA的缺失和重新排列，或对基因调控的干扰。
3)基因组编辑的动物可能更容易受到基因组编辑产生的遗传错误的影响，但是遗传错误也已经在许多植物中得到了证明(例如，Zhu et al., 2017[2]; Wolt et al. 2016[3])。沃尔特等人的研究(Wolt et al. 2016)列出了植物的脱靶效应表。
旋转结果
迄今为止，这是一项进行得很好的研究，它在将基因编辑过程分为不同的成分并确定哪个成分引起了多少种特定类型的突变方面开辟了新的领域。
然而，可悲的是，这项研究的作者陷入基因编辑这个高度政治化领域困扰着许多研究人员陷入的同样陷阱。看来这些作者意识到他们的结果不仅确实令人震惊而且反而支持那些对基因编辑技术持谨慎态度人的情况，作者必定自问如何旋转结果，以免同业者听起来不那么坏。
这就是他们跨越界的地方，他们本应将科学与炒作以及客观研究与倡导分开。他们与转基因(GMO)行业和生物技术行业的首席执行官游说得出的相同结论是：“我们的数据支持了最近的一项呼吁，即应当“规范基因组编辑的产品，而不是基因组编辑本身”。
这种奇怪的说法与这项研究作者自己的发现完全不符。中国学者研究的结果表明，从整体上讲，CRISPR(基因编辑)过程可诱导数百个程序诱导的突变。他们表明该过程本质上是有问题的。因此，仅基于最终产品的预期进行监管显然与科学(包括作者自己的结果)告诉我们的情况截然相反。
因此，尽管生物技术行业游说者和研究作者都正确地说新论文将为监管机构提供有价值的参考，但是他们声称支持进队纯产品监管是错误的。相反，该文件为基于过程的监管提供了最清晰的证据，例如欧盟当前已经建立的。
Claire Robinson, New study claimed to show safety of CRISPR shows the opposite,
GM Watch, 29 Jan 2019
Claire Robinson，声称显示CRISPR安全性的新研究表明相反结果。
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